Lector de placas

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Lector de placas

Un lector de placas (también conocido como lector de microplacas) es un instrumento de laboratorio que permite detectar eventos biológicos, químicos o físicos en muestras contenidas en placas de microtitulación. Son ampliamente utilizados en investigación, descubrimiento de fármacos, validación de bioensayos, control de calidad y procesos de fabricación en la industria farmacéutica, biotecnológica y en organizaciones académicas.

Algunas reacciones y ensayos qu√≠micos pueden ser probados en placas de microtitulaci√≥n con un n√ļmero de 6 a 1536 pocillos. El formato de microplaca m√°s com√ļnmente utilizado en los laboratorios de investigaci√≥n acad√©mica o en laboratorios de diagn√≥stico cl√≠nico es de 96 pozos (matriz de 8 por 12) con un volumen de reacci√≥n t√≠pica comprendido entre 100 y 200 őľL por pozo. Las microplacas con mayor n√ļmero de pozos (de 384 a 1536) se utilizan normalmente para aplicaciones de detecci√≥n, cuando el rendimiento (n√ļmero de muestras procesadas por d√≠a) y el costo por ensayo son los par√°metros cr√≠ticos, con un volumen de ensayo t√≠pico entre 5 y 50 őľL por pozo . Los modos comunes de detecci√≥n para los ensayos de microplacas son: absorbancia, intensidad de fluorescencia, luminiscencia, fluorescencia resuelta en el tiempo y polarizaci√≥n de fluorescencia.

Contenido

Detección de absorbancia

Ensayo MTT de viabilidad celular en una microplaca para estudio de absorbancia. Una mayor intensidad de color p√ļrpura est√° relacionada con una mayor cantidad de c√©lulas viables, con un metabolismo activo

La detección o medida de la absorbancia ha estado disponible en los lectores de microplacas desde hace más de tres décadas, y se utiliza para ensayos, como los análisis ELISA, para cuantificación de proteínas y ácidos nucleicos o para ensayos de actividad enzimática (como el ensayo MTT para estudiar la viabilidad celular). Una fuente de luz ilumina la muestra con una longitud de onda específica (seleccionada mediante un filtro óptico, o un monocromador), y un detector de luz situado en el otro lado del pozo mide qué porcentaje de la luz inicial (100%) se transmite a través de la muestra: la cantidad de luz transmitida estará relacionada con la concentración de la molécula de interés.

Detección de fluorescencia

La detecci√≥n de la intensidad de fluorescencia en el formato de microplacas se ha desarrollado de manera amplia durante las √ļltimas dos d√©cadas. La gama de aplicaciones es mucho m√°s amplia que cuando se utiliza la detecci√≥n de absorci√≥n, pero los lectores de placas necesarios son generalmente m√°s caros. En este tipo de lectores, un primer sistema √≥ptico (sistema de excitaci√≥n) ilumina la muestra con una longitud de onda espec√≠fica (seleccionada mediante un filtro √≥ptico, o un monocromador). Como resultado de la iluminaci√≥n, la muestra emite luz (fluorescencia) y un segundo sistema √≥ptico (sistema de emisi√≥n) recoge la luz emitida, la separa de la luz de excitaci√≥n (utilizando un sistema de filtro o monocromador), y mide la se√Īal mediante un detector de luz, como un tubo fotomultiplicador.[1] Las ventajas de los lectores de fluorescencia respecto de los lectores de absorbancia son la sensibilidad, as√≠ como el campo de aplicaci√≥n, dada la amplia selecci√≥n de suatancias para marcado fluorescente disponibles en la actualidad, por ejemplo, una t√©cnica conocida como im√°genes de calcio mide la intensidad de fluorescencia de tintas sensibles al calcio para evaluar los niveles de calcio intracelular.

Luminiscencia

Los lectores de microplacas para detección de luminiscencia son muy populares para ciertas aplicaciones específicas. La diferencia con la fluorescencia es que la luz emitida por las muestras es el resultado de una reacción química o bioquímica (en lugar de ser el resultado de la excitación por la luz. Los lectores de placas para luminiscencia son ópticamente más simples que los lectores de fluorescencia, ya que no requieren una fuente de luz, sólo un detector de luz. Normalmente, el sistema óptico consiste en una cámara de lectura aislada de la luz exterior, y un tubo fotomultiplicador como detector para medir la luz emitida por las muestras durante la reacción. Las aplicaciones comunes incluyen análisis de genes basados en expresión de luciferasa, así como ensayos de viabilidad celular y de citotoxicidad basados en la detección luminiscente de ATP.

Fluorescencia resuelta en el tiempo

Los lectores para medici√≥n de fluorescencia resuelta en el tiempo (Time-Resolved Fluorescence, TRF) son muy similares a los lectores de intensidad de fluorescencia. La √ļnica diferencia es el momento de la excitaci√≥n y del proceso de medici√≥n. Cuando se mide la intensidad de fluorescencia, los procesos de excitaci√≥n y de emisi√≥n son simult√°neos: la luz emitida por la muestra es medida mientras la excitaci√≥n se lleva a cabo. A pesar de que los sistemas de emisi√≥n son muy eficientes en la eliminaci√≥n de la luz de excitaci√≥n antes de llegar al detector, la cantidad de luz de excitaci√≥n en comparaci√≥n con la luz emitida es tal que las mediciones siempre muestran se√Īales de fondo muy elevadas. La fluorescencia resuelta en el tiempo ofrece una soluci√≥n a este problema. Se basa en la utilizaci√≥n de mol√©culas fluorescentes muy espec√≠ficas, llamadas lant√°nidos, que tienen la caracter√≠stica inusual de emitir durante largos per√≠odos de tiempo (medidos es milisegundos) despu√©s de la excitaci√≥n, cuando la mayor√≠a de los pigmentos fluorescentes est√°ndar (por ejemplo, la fluoresce√≠na) emiten s√≥lo unos pocos nanosegundos despu√©s de la excitaci√≥n. Como resultado, es posible excitar lant√°nidos utilizando una fuente de luz pulsada (l√°mpara de flash de xen√≥n o un l√°ser pulsado, por ejemplo), y medir despu√©s del pulso de excitaci√≥n. Esto se traduce en fondos de medici√≥n m√°s bajos que en los ensayos est√°ndar de intensidad de fluorescencia. Las desventajas son que la instrumentaci√≥n y los reactivos son habitualmente m√°s caros, y que las aplicaciones tienen que ser compatibles con el uso de estos colorantes lant√°nidos muy espec√≠ficos. El uso principal de la fluorescencia resuelta en el tiempo se encuentra en las aplicaciones de detecci√≥n de f√°rmacos, en la modalidad denominada TR-FRET (tiempo de transferencia de energ√≠a de fluorescencia resuelta).[2] Los ensayos TR-FRET son muy robustos (limitada sensibilidad a varios tipos de interferencias con el ensayo) y son f√°cilmente miniaturizados. La robustez y las capacidades de automatizaci√≥n y miniaturizaci√≥n son caracter√≠sticas muy atractivas en un laboratorio de an√°lisis.

Polarización de fluorescencia

Los lectores de polarizaci√≥n de fluorescencia para microplacas son tambi√©n bastante similares a los de detecci√≥n de intensidad de fluorescencia. La diferencia es que el sistema √≥ptico incluye filtros polarizadores en la trayectoria de la luz: las muestras en la microplaca se excitan con luz polarizada (en lugar de la luz no polarizada empleada en otros m√©todos). Dependiendo de la movilidad de las mol√©culas fluorescentes que se encuentran en los pozos, la luz emitida es polarizada o no. Por ejemplo, las mol√©culas grandes (prote√≠nas, por ejemplo) en disoluci√≥n, giran con relativa lentitud debido a su tama√Īo, y emiten luz polarizada cuando son excitadas con luz polarizada. Por otro lado, la rotaci√≥n r√°pida de las mol√©culas m√°s peque√Īas se traducir√° en una despolarizaci√≥n de la se√Īal. El sistema de emisi√≥n del lector de placas utiliza filtros polarizadores para analizar la polaridad de la luz emitida. Un bajo nivel de polarizaci√≥n indica que las peque√Īas mol√©culas fluorescentes circulan libremente por la muestra. Un alto nivel de polarizaci√≥n fluorescente indica la presencia de un gran complejo molecular. Como resultado, entre las aplicaciones b√°sicas de los lectores de polarizaci√≥n de fluorescencia est√°n los ensayos de uni√≥n molecular, ya que permiten detectar si una peque√Īa mol√©cula fluorescente est√° enlazada (o no) con una m√°s grande, la mol√©cula no fluorescente: el enlace da como resultado una velocidad de rotaci√≥n m√°s lenta de la mol√©cula fluorescente, y un aumento en la polarizaci√≥n de la se√Īal.

Lectores multimodales

Estos modos de detección (absorbancia, intensidad de fluorescencia, luminiscencia, fluorescencia resuelta en tiempo, y polarización de la fluorescencia) están disponibles en lectores de multiplacas autónomoss, pero muy a menudo se encuentran combinados en un solo instrumento (lector multimodal de placas). La gama de aplicaciones para los lectores multimodales de placas es extremadamente grande. Algunos de los ensayos más comunes son:

Otros lectores de placas

Mientras que un "lector de placas" es cualquiera de los dispositivos descritos anteriormente, también están disponibles algunas variaciones. Otros ejemplos de dispositivos que trabajan con el formato de microplacas son:

  • Lectores de placas ELISPOT, que sirven para contar los puntos de colores que se forman en el curso de los ensayos ELISPOT.
  • Procesadores de im√°genes de alto rendimiento, que pueden medir todos los pocillos de una microplaca a la vez.
  • Sistemas de cribado de alto contenido que muestran la imagen de cada pocillo con alta resoluci√≥n, para ver poblaciones de c√©lulas.
  • Otros instrumentos que emplean microplacas especializadas para medir eventos de enlace sin el uso de marcadores qu√≠micos.

Enlaces externos

Referencias


Wikimedia foundation. 2010.

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